Wspólnym wykładnikiem bakterii grupy coli z rodziny Enterobacteriaceae są cechy morfologiczne i biochemiczne, które w normie ISO 9308-1 przedstawione są jako względnie beztlenowe, Gram-ujemne, nie tworzące przetrwalników, manifestujące się w ciągu 24 godzin na agarze w postaci czerwonych kolonii w temperaturze 35°C. Kolejne wytyczne ISO-9308-2 mówią o tych bakteriach, że są względnie beztlenowymi, Gram-ujemnymi, nieprzetrwalnikującymi pałeczkami fermentującymi laktozę z wydzieleniem kwasów i gazów w ciągu 48 godzin w temperaturze 35°C.
Rozpoznanie bakterii bardzo przyśpieszają testy biochemiczne oparte na relacji charakterystycznych dla danego taksonu reagentów reakcji metabolicznych. Jednym z nich jest katalizujący hydrolizę β-D-glukopiranozydowych pochodnych w odpowiednie aglikony i kwas D-glukuronowy enzym β-D-glukuronidaza o szczególnej aktywności wśród przedstawicieli Enterobacteriaceae, zwłaszcza pałeczek E.coli. Za hydrolizę laktozy do galaktozy i glukozy odpowiedzialny jest kolejny enzym: β-D-galaktozydaza znamienna w diagnostyce gatunkowej grupy coli w obrębie rodziny Enterobacteriaceae. Istotą potwierdzenia obecności któregoś z dwu enzymów na podłożach chromogennych lub fluorogennych jest zmiana zabarwienia lub pojawienie się fluorescencji.
Odpowiedzialnymi za zmianę zabarwienia podłoża chromogennego w wyniku wykrycia owego enzymu są substraty chromogenne: indoksylo-β-D-glukuronid (IBDG), kompleks fenoloftaleiny i mono-β-D-glukuronidu oraz 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-Dglukuronid. Natomiast do najpowszechniejszych substratów fluorogennych należy: 4-metyloumbeliferylo-β-D-glukuronid. Pożywki z takimi chromogenami jak: o-nitrofenylo-β-D-galaktopirazyd i 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopiranozyd (OPNG), p-nitro-β-D-galaktropiranozyd (PNPG), 6-bromo-2-naphtyl-β-D-galaktopiranozyd i 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-Dgalaktopiranozyd (X-Gal) oraz fluorogen 4-metyloumbeliferylo-β-D-galaktopiranozyd (MUG) służą do różnicowania bakterii grup coli ze względu na swoją reaktywność z β-D-galaktozydazą.
Zaangażowanie fluorogennego substratu w skład bulionu laurylowo-tryptozowego usprawniło metodę fermentacyjno-probówkową, polegającą na na zdolności tych bakterii do fermentowania laktozy z wytworzeniem w podłożu kwasu (zmiana zabarwienia pożywki z fioletowej na żółtą) oraz gazu (w rurkach Durhama umieszczonych w probówkach). Błękitna fluorescencja jest wynikiem hydrolizy MUG przez β-D-glukuronidazę do metyloumbeliferonu i expozycji próbki na promieniowanie UV.
Efektem wykorzystania enzymatycznego profilu drobnoustrojów są metody zdefiniowanych substratów (DST) (ang. Defined Substrate Technology), wykorzystane zarówno w metodzie FP jak i metodzie filtracji membranowej, polegającej na przepuszczeniu przez odpowiedni filtr badanej płynnej próbki i nałożeniu owego filtra następnie na powierzchnię podłoża stałego. W opozycji do tych procedur eliminujących wzrost bakterii nie metabolizujących laktozy stoi technologia z zastosowaniem detekcji określonych enzymów, której istota jest umożliwienie wzrostu bakterii tylko, w tym przypadku, z grupy coli i E. coli.
Swoistość enzymu β-D-galaktozydazy dla całej grupy coli oraz MUG - dla bakterii E. coli sprowokowała do wykorzystania dla nich substratu ONPG. Pierwotnie procedura tego testu polegała na dodaniu do bezbarwnej pożywki badanej próbki i inkubacji temperaturze 35°C, w wyniku czego za wynik pozytywny dla bakterii grupy coli uznano żółty kolor podłoża. Obecność E. coli ściśle potwierdzała błękitna fluorescencja w wyniku ekspozycji na promieniowanie UV pozytywnych próbek. Specyficzność metody nie wymaga żadnych dodatkowych testów.
Na podstawie owych metod enzymatycznych opracowano takie testy, jak: Colilert (IDEXX Laboratories, Portland, ME, USA), Colisure (IDEXX Laboratories, Portland, ME, USA), Coli-Fast (Hach, Loveland, CO, USA), Readycult COliforms (Merck, Darmstadt, Niemcy). Większość z nich umożliwia postępowanie jakościowe i ilościowe weryfikacji tych drobnoustrojów.
Najpowszechniejszym w laboratoriach rutynowo monitorujących skażenia wód testem jest Colilert oparty na technologii DST z substratem chromogennym ONPG oraz fluorogennym MUG. Wytypowana metoda okazuje się być niezawodna w identyfikacji E.coli w wodach o dużym zróżnicowaniu mikrobiologicznym. Na rynku znajduje się również ilościowy wariant testu Colilert wykorzystujące specjalne tacki Quanti-Tray (QT) stanowiących duże uproszczenie metody posiewu na podłoże płynne oraz określenie na podstawie jej obserwacji i statystycznych obliczenia najbardziej prawdopodobnej liczby (NPL) drobnoustrojów. Ułatwienie ściąga z laboranta obowiązek wykonywania żmudnych rozcieńczeń próbki.
Oto kolejne wersje Colilertu: tradycyjny Colilert®, identyfikujących bakterie z grupy coli po 24 godzinach, Colilert 18®, redukujący czas oczekiwania o 6 godzin oraz Colisure™, przydatny w oznaczaniu zabarwionych wód powierzchniowych.
Diagnostyka bakteriologiczna przy pomocy testów Colilert i Colisure nadają się do wykrywania i oznaczenia ilościowego drobnoustrojów z grupy coli i E. coli w wodach zarówno tych czystych, nadających się do picia, jak i tych bardzo zanieczyszczonych. Korzyści wynikające z korzystania z tej metodyki to przede wszystkim szybkość, łatwość i wiarygodność wyników. Nie przemawia jednak do kierowników placówek badawczych i diagnostycznych cena takich testów. Stosunek kosztów metody tradycyjnej i Colilert ulega jednak zaburzeniu, kiedy dla potwierdzenia zanieczyszczenia wód potrzebna jest weryfikacja kilku lub kilkunastu hodowli. Nowoczesne testy Colilert zdobyły uznanie U.S. Environmental Protection Agency (EPA), przez co duża część amerykańskich, kanadyjskich, japońskich i europejskich laboratoriów używa ich w rutynowym różnicowaniu. To nie koniec z pochlebstwami, ponieważ testy Colilert afirmują takie jednostki opiniotwórcze, jak: ASTM (American Society for Testing and Materials), AOAC (Association of Analitycal Communities), IBWA (International Bottled Watercooler Association) oraz Francuska Organizacja Normalizacyjna AFNOR. Z końcem 2012 roku metoda COlilert® 18/Quanti-Tray® stała się nowym standardem ISO 9308-2:2012 do wykrywania bakterii grupy coli i E. coli w wodzie, nadając im inną, nowszą i dokładniejszą definicję, przez co bez żadnych przeciwwskazań ów test jest substytutem metody fermentacyjno-probówkowej.
Daniel Kamocki
Źródło:
dr inż. Dorota Kręgiel. Testy Colilert-szybkie wykrywanie oraz ilościowe oznaczanie bakterii grupy coli. Laboratorium. Przegląd ogólnopolski. 2013, nr 2, s. 32-34, ISSN 1643-7381, <http://www.agro.e-bmp.pl/test-na-czystosc-wody,5310,art.html>
