Technika FISH (ang. Fluorescence in situ Hybridization) jest oparta na hybrydyzacji kwasów nukleinowych in situ, czyli proces hybrydyzacji przebiega na szkiełku laboratoryjnym, w miejscu ich występowania. W zakresie hybrydyzacji molekularnej możemy wyróżnić następujące metody: Southern blotting, Northern blotting czy właśnie technikę FISH. Metoda FISH pozwala wykryć w analizowanym materiale przy użyciu specyficznych fluorescencyjnych sond specyficzną sekwencję kwasu nukleinowego. Metodę tę stosuje się w szczególności w identyfikacji mikroorganizmów. Denaturacja chromosomów jest kluczowym etapem w analizie za pomocą techniki FISH. Zgodnie z regułą komplementarności, zdenaturowany fragment DNA dąży do połączenia się z druga nicią. Badanie za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ możemy przeprowadzić na limfocytach, fibroblastach, komórkach szpiku, trofoblastu czy nabłonku jamy ustnej. W zależnosci od rozmiaru I przeznaczenia stosuje się różne rodzaje sond. Mogą to być sondy:
• malujące (ang. Whole Chromosome Painting, WCP)
• alfa-satelitarne, inaczej centromerowe czy telomerowe (ang. Centromeric Enumaration Probes, CEP)
• specyficzne (ang. Locus Specific Identifier, LSI)
Do analizy wyników procesu hybrydyzacji konieczny jest mikroskop fluorescencyjny, który umożliwia detekcję barwnych sygnałów na chromosomach. Początkowo jako znaczniki wykorzystywano izotopy, które z rozwojem techniki zastąpiono barwnikami immunofluorescencyjnymi.
Metoda ta jest nieoceniona w przypadku diagnostyki preimplanatacyjnej czy cytogenetycznej komórek nowotworowych oraz wielu innych. Mimo, że posiada szereg zalet, m.in szybki czas uzyskania wyniku oraz analizę na poziomie pojedynczej, jest stosunkowo kosztowną metodą z uwagi na wysoki koszt sond (w zależności od rodzaju ceny kształtują się od 500 - 10 000 złotych) oraz brak możliwości analizy całego kariotypu.
Porównawcza hybrydyzacja genomowa (ang. Comparative Genomic Hybridization, CGH) jest metodą cytogenetyczną, w której utrata bądź amplifikacja regionów chromosomowych jest wykrywana w skali prążka chromosomowego. Wykorzystuje reakcję podwójnej hybrydyzacji z sondami molekularnymi. DNA referencyjne i badane ulega hybrydyzacji do chromosomów znajdujących się w stadium metafazy, co umożliwia wykrycie delecji i duplikacji. Do zalet tej metody z pewnością należy fakt, iż umożliwia ona analizę wszystkich chromosomów, bez obowiązku prowadzenia hodowli komórek pacjenta. Tak, jak w przypadku techniki FISH, pozwala na badanie pojedynczej komórki.
Źródła:
Grafika wg [1], zmodyfikowano
[1] Achrem W., Parafiniuk-pacholska M., Fluorescencyjna hybrydyzacja in-situ i metoda laserowego pozyskiwania mikroskrawkó (LCM) w genetycznych badaniach kryminalistycznych
[3] http://kgm.ump.edu.pl/fileadmin/user_upload/genetyka/konspekty/analityka/Strategia_diagnostyki_cytogenetycznej.pdf
[4] http://biotechnologia.pl/archiwum/fish-fluorescent-in-situ-hybrydization,1655
[6] http://biotechnologia.pl/archiwum/fish-fluorescent-in-situ-hybrydization,1655
[7] http://www.pg.gda.pl/chem/pl/zamawiane/images/stories/w-%205-7.pdf
