Według specyfikacji podanej przez producenta, praca z fluorymetrem zapewnia wysoką jakość oznaczeń bez ponoszenia wysokich kosztów, a wbudowany procesor pozwala na sterowanie urządzeniem wykazującym się doskonałą czułością pomiaru rzędu 0,1 μg/l wyznaczaną wobec siarczanu chininy w 0,1 M H2SO4[1].
Źródłem promieniowania wzbudzania (o długości mieszczącej się w zakresie od 200 nm do 600 nm) jest łukowa lampa ksenowowa wolna od ozonu. Poszerzenie zakresu długości promieniowania wzbudzenia do 700 nm można zgłosić przed zakupem analizatora, ponieważ jest to aktywowana fabrycznie opcja. Do detekcji promieniowania emisyjnego wykorzystany został fotopowielacz, z którego sygnał elektryczny trafia do 3,5-cyfrowego wyświetlacza, czyli takiego, w którym zakres ekstremalnych wartości mieści się w granicach 0000-1999. Śledzenie pracy fluorymetru umożliwiają trzy wyjścia: analogowe, typu centronics i RS-232.
Wspomniane wcześniej filtry pozwalają na modelowanie długości światła, i tak: pierwszy służy do wybrania określonej długości fali padającej na próbkę, drugi monochromatyzuje światło emitowane przez próbkę, umieszczony jest on zwykle za próbką pod kątem 90° w stosunku do światła padającego na próbkę, zatem dociera do niego tylko promieniowanie emitowane. Każde oznaczanie wymaga odpowiedniego doboru pary filtrów, których gama jest naprawdę szeroka, jednak w większości takie konfiguracje uzależnione od profilu pomiaru są dostępne na zamówienie. Można nabyć filtry pasmowe o parametrach: 620124 BG28 w zakresie 380-500 nm, 620 125 VG9 w zakresie 480-580 nm, 620 126 UG1 w zakresie 320-380 nm. Kolejne propozycje to filtry z punktami odcięcia wynoszącymi, m.in. dla modułu 620127 Kodak 29 - 610 nm, 620 128 IIford 201 - 545 nm, 620 129 Kodak 8 - 475 nm, 620 130 Kodak 28 - 395 nm, a dla ostatniego 620 131 Glass natomiast 305 nm. W zależności od potrzeb można nabyć filtry interferencyjne, które znoszą zakłócenia przy takich liniach: 254 nm, 340 nm, 380 nm, 400 nm, 470 nm, 514 nm dla odpowiadających im ofert: 620 132, 620 133, 620 134, 620 135, 620 136, 620 137.
Komora próbnika fluorymetru 6200 jest przystosowana dla szerokiego zakresu kuwetek, w tym nawet tych najmniejszych, bo zajmujących 8 μl. Różnorodność ta wynika z ich budowy (całkowite przepuszczenie promieniowania emisyjnego przez ściany kuwety). Kuwety są o wymiarach 10x10 mm i przystosowane są do odpowiednich zakresów długości fali elektromagnetycznej: 060247 - zestaw 100 kuwet plastikowych, 060253 - komórki szklane (znamienne dla nadfioletu), 060254 - kuwetki ze szkła (dla zakresu światła widzialnego), 060256 - szklane komórki (przeznaczone do emisji UV) 060257 - kuwetki szklane (przepuszczające promieniowanie widzialne).
O funkcjonalnościach i teście fluorymetru pisał w "International Journal of Analytical Chemistry" zespół naukowców z Uniwersytetu im. Króla Sauda w Rijadzie, poddając oznaczeniu w preparatach farmaceutycznych chlowodorek fluoksetyny, FLX, substancję stosowaną w zaburzeniach depresyjnych i obsesyjno-kompulsyjnych, występującą w popularnym leku pod nazwą Prozac [2]. Badacze zastosowali dwie metody, spektroflurymetryczną i fluorymetryczną. W ostatniej właśnie wykorzystali fluorymetr Jenway 6200, opierając oznaczenie na reakcji FLX z 4-chloro-7-Nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazolem (NBD -CI) w środowisku alkalicznym (pH = 8) z wytworzeniem wysoce fluorescencyjnego produktu, emitującego promieniowanie o długości 545 nm po wzbudzeniu linią 490 nm. Po starannym zoptymalizowaniu reakcji i zbadaniu kinetyki i mechanizmu reakcji otrzymano liniową zależność natężenia fluorescencji w funkcji stężenia dla przedziału 0,035-0,5 μg/ml. Limit wykrywania wyniósł 0,01 mg/ml.
Kolejnymi badaczami, którzy poddali weryfikacji analizator w celu określenia funkcji biologicznej czynnika aktywującego płytki krwi, PAF, w przewlekłym zapaleniu, byli publikujący na łamach "British Journal of Pharmacology"[3] naukowcy śledzący kinetykę angiogenezy i rekrutację komórek zapalnych u zainfekowanych myszy typu dzikiego i tych z niedoborem receptora PAF (PAFR-KO). Analiza morfometryczna i stężenie hemoglobiny wskazały u zwierząt transgenicznych na znaczną angiogenezę. Po oznaczeniu aktywności mieloperoksydazy i N-acetyloglukozaminidazy w supernatancie utrzymującym się nad homogenizatem tkanki dotkniętej zapaleniem doszukano się rozbieżności w nagromadzeniu neutrofilów i makrofagów. Otóż duża liczba komórek procesu zapalnego była znamienna dla myszy typu dzikiego. Nieoczekiwanym rezultatem przedsięwzięcia okazało się nadmierne pojawienie się chemokin zapalnych i tych pochodzących od keratynocytów (KC) oraz akumulacja białek chemotaktycznych dla monocytów (MP1) u gryzoni pozbawionych receptora czynnika aktywacji płytek krwi. Okazało się, że PAF jest endogennym regulatorem tworzenia nowych naczyń krwionośnych. W tej złożonej inicjatywie fluorymetrem posłużono się dla określenia farmakologicznej reaktywności naczyń podskórnych obu populacji myszy na czynnik PAF. Lokalny przepływ krwi odzwierciedlony został przez emisję promieniowania zastosowanego bezpośrednio w naczyniach barwnika fluorescencyjnego, a działanie egzogennej substancji rozszerzającej naczynia miał wpływ na intensywność fluorescencji. Dokładna procedura wyglądała następująco: sterylny roztwór fluoresceiny sodu wstrzykiwano śródskórnie w dwie minuty po miejscowej aplikacji PAF. Próbki krwi pobrano z żyły ogonowej w kolejnych odstępach czasu od iniekcji barwnika, a następnie zmieszano z izotonicznym roztworem soli fizjologicznej, odwirowano, a supernatant poddano określeniu fluorescencji we fluorymetrze Jenway 6200 przy długościach promieniowania wzbudzenia i emisji odpowiednio: 485 i 520 nm.
W kolejnym badaniu przeprowadzonym przez A. E. Bawazira określano wpływ podawanej samcom szczurów albinosów doustnie talbiny (arabskiego przysmaku, przygotowywanego z otrębów jęczmiennych, mleka i miodu) na działanie kortyzolu, testosteronu i neuroprzekaźników, a także na funkcję jąder gryzoni [4]. Wyniki przewlekłej ekspozycji wskazały nieznaczny wzrost stężenia noradrenaliny (NE) oraz istotny wzrost poziomu dopaminy (DA), serotoniny (5-HT) i kwasu γ-aminomasłowego (GABA), zawartych w różnych obszarach mózgu (móżdżek, prążkowie, kora mózgowa, podwzgórze, pień mózgu i hipokamp). Dodatkowo w trzecim tygodniu przewlekłego narażenia zauważono największą akumulację DA, GABA i 5-HT w korze mózgowej, a w czwartym tygodniu ekspozycji zaobserwowano maksymalny wzrost zawartości GABA w tym samym obszarze oraz podniesienie się poziomu kortyzolu i testosteronu we krwi. Natomiast same kanaliki plemnikotwórcze przejawiały nasiloną spermatogenezę. Wedle metody zaproponowanej przez Changa [5] i zmodyfikowanej przez Ciarlone [6] wyekstrahowano i oszacowano poziomy NE, DA, 5-HT i GABA.Fluorescencję za pomocą fluorymetru Jenway 6200.
Naukowcom z Uniwersytetu w Cambridge fluorymetr Jenway 6200 posłużył w ocenie zdolności uwalniania glutaminianu z izolowanych zakończeń nerwowych mózgu szczura w wyniku działania wysokiego stężenia tlenku azotu, powodującego w konsekwencji zahamowanie oddychania mitochondrialnego na poziomie oksydazy cytochromowej oraz obumarcia neuronów [7]. Wykazano, że poza tlenkiem azotu niezależne od nagromadzenia jonów wapniowych uwolnienie glutaminianu wywołują również kompleks sperminy z NO oraz cyjanek potasu. Metodyka oznaczenia glutaminianu w synaptosomach, czyli oderwanych zakończeniach nerwowych zawierających przestrzeń synaptyczną wraz z przylegającymi do niej rejonami komórki nerwowej, polegała na inkubacji białka synaptosomalnego w temperaturze 37°C w towarzystwie odpowiedniego medium, na który składały się: NaCl, KCl, KH2PO4, MgSO4 , NaHCO3 , TES, albumina surowicy bydlęcej oraz D-glukoza. Następnie mieszaninę poddano oznaczeniu fluorymetrycznemu za pomocą modelu Jenway 6200® przy długości fali promieniowania wzbudzenia równej 330-360 nm. Fluorescencję próbki uchwycono przy długości fali emitowanej o wartości 380 nm. Około 4 minuty później dodano NADP i dehydrogenazę glutaminianową, czemu towarzyszyło dołożenie CaCl2 dla uwolnienia tradycyjną drogą glutaminianu lub sodowego EGTA, w celu określenia niezależnego od wapnia szlaku uwalniania glutaminianu. W dwie minuty po tym poziom glutaminianu po dodaniu AP, NO, kompleksu sperminy i NO oraz KCN wyrażono kolejnym pomiarem na fluorymetrze, według metodyki Nichollsa z 1987 roku [8].
Źródła:
[1] http://www.somatco.com/FL-6200.pdf
[2] Ibrahim A. Darwish,* Sawsan M. Amer, Heba H. Abdine, and Lama I. Al-Rayes New Spectrophotometric and Fluorimetric Methods for Determination of Fluoxetine in Pharmaceutical Formulations. Int J Anal Chem. 2009; 2009: 257306. Published online Aug 16, 2009. doi: 10.1155/2009/257306
[3] Mônica A N D Ferreira, Lucíola S Barcelos,2 Paula P Campos,1 Anilton C Vasconcelos,1 Mauro M Teixeira,2 and Silvia P Andrade Sponge-induced angiogenesis and inflammation in PAF receptor-deficient mice (PAFR-KO) Br J Pharmacol.2004, 4, 141(7): 1185-1192.
[4] A.E. Bawazir Investigations on the Chronic Effect of Talbina (Barly Water ) on Hormone (Cortisol and Testosterone), Reproductive System and Some Neurotransmitter Contents in Different Brain Areas of Male Albino Rats. American-Eurasian Journal of Scientific Research.2010, 5 (2): 134-142, 2010 ISSN 1818-6785
[5] Chang, C.C., A sensitive method for spectrofluorometric assay of catecholamines. Int. J.Neuropharmacol.1964, 4: 643-649.
[6] Ciarlone, A.E., Further modification of a fluoremetric method for analyzing brain amines Microchem. J.1978, 23: 9-12
[7] Kevin St. P. McNaught and Guy C. Brown. Nitric Oxide Causes Glutamate Release from Brain Synaptosomes. Journal of Neurochemistry Lippincott—Raven Publishers, Philadelphia © 1998 International Society for Neurochemistry
[8] Nicholls D. G., Sihra T. S., and Sanchez-Prieto J. Calciumdependent and -independent release of glutamate from synaptosomes monitored by continuous fluorometry. J. Neurochem.1987, 49, 50-57.
