METODA IDENTYFIKACJI WIRUSÓW RNA W DIAGNOSTYCE WIRUSOLOGICZNEJ

(PROJEKT NR P-179)

Zakażenia wirusowe są związane z licznymi chorobami ludzkimi oraz zwierzęcymi. Jednakże ze względu na trudności w identyfikacji wirusów oraz ich dużą zmienność, czynniki etiologiczne licznych chorób pozostają nieznane, jak na przykład w chorobie Kawasakiego. Przykładem trudności w identyfikacji wirusów w materiale klinicznym są choroby układu oddechowego. Trwające od wielu lat badania nad tymi chorobami wciąż prowadzą do identyfikowana nowych wirusów np. ludzkiego koronawirusa NL63 lub HKU1, ludzkiego bokawirusa, wirusa SARS lub koronawirusa EMC. Niemożność ich identyfikacji wynika z dużej zmienności wirusów oraz z niedoskonałego systemu detekcji.

Obecnie wykorzystywane metody identyfikacji znanych wirusów obejmują szereg metod, poczynając od hodowli komórkowych, poprzez testy na obecność antygenów, aż po metody molekularne pozwalające na amplifikację kwasów nukleinowych. Do metod molekularnych można zaliczyć również metody pozwalające na identyfikację nowych wirusów lub wariantów wirusów niewykrywalnych standardowymi metodami. Najbardziej czułą metodą identyfikacji wirusów jest wykorzystanie starterów uniwersalnych w standardowej amplifikacji kwasów nukleinowych. W metodyce tej wykorzystuje się obecność stałych, konserwatywnych miejsc w genomach wirusów należących do pojedynczej rodziny. Wykorzystanie takich miejsc dla projektowania starterów pozwala mieć nadzieje, że w przypadku nieznanych wirusów fragmenty te również będą obecne i możliwa będzie amplifikacja i identyfikacja nowych wirusów lub nowych wariantów znanych wirusów. Największą wadą tej metody jest jej skuteczność ograniczona tylko do wirusów, które posiadają identyczne elementy o długości 18-25 nukleotydów, co świadczy o ich pokrewieństwie. Pewnym udogodnieniem w tym wypadku jest metoda CODEHOP, która umożliwia wykorzystanie konserwatywnych fragmentów białek i projektowanie silnie zdegenerowanych starterów.

Przedmiotem wynalazku jest nowa metoda identyfikacji wirusów RNA polegająca na wykorzystaniu krótkich 6-8 nukleotydowych elementów DNA, jako miejsc przyłączenia specyficznych starterów w reakcji PCR w reakcji odwrotnej transkrypcji. Metoda obejmuje również syntezę drugiej nici DNA, co pozwala
na dodanie do fragmentu kwasu nukleinowego syntetycznych adapterów pozwalających na późniejszą amplifikację materiału genetycznego wirusów RNA. Jest to modyfikacja obecnie stosowanej standardowej reakcji PCR.

Główną zaletą opisywanej metody jest znaczne skrócenie miejsc konserwatywnych niezbędnych dla namnożenia kwasu nukleinowego w porównaniu do standardowej reakcji PCR z wykorzystaniem starterów uniwersalnych. Uzyskane produkty mogą zostać następnie poddane analizie, przykładowo z wykorzystaniem analizy wielkości (np. na żelu agarozowym lub poliakrylamidowym) lub z wykorzystaniem sekwencjonowania.

Do innych zalet proponowanej metody należą:

• możliwość stosowania metody w identyfikacji wirusowego RNA także
  w próbkach klinicznych;
• większa specyficzność w stosunku do obecnie stosowanych metod PCR
  z użyciem starterów uniwersalnych;
• prostota realizacji.

Oferowana metoda identyfikacji wirusów RNA stanowi przedmiot zgłoszenia patentowego. Dalsze prace nad jej rozwojem są prowadzone na Wydziale Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii UJ, a Centrum Innowacji, Transferu Technologii i Rozwoju Uniwersytetu poszukuje podmiotów zainteresowanych komercyjnym wykorzystaniem wynalazku.

Dalsze informacje:

dr Klaudia Polakowska                                     tel. 12 663 3832, fax: 12 663 3831

Specjalista ds. Transferu Technologii           e-mail: klaudia.polakowska@uj.edu.pl

CITTRU, Uniwersytet Jagielloński

www.cittru.uj.edu.pl

____________________________________________________________________________________________________

IDENTIFICATION METHOD IN THE DIAGNOSIS OF rna viruses

 (TECHNOLOGY OFFER P-179)

Viral infections are associated with numerous human and animal diseases. However, due to difficulties in identification of viruses and their high variability, the etiological factors of numerous diseases are unknown, as for example in a Kawasaki’s disease. The respiratory diseases are the examples of difficulties in identification of viruses in clinical material. Lasting many years research on these diseases  still lead to the identification of new viruses, e.g. human coronavirus NL63 or HKU1, human bocavirus, SARS virus or EMC coronavius. The inability to their identification is due to high variability of viruses and the imperfect detection system.

Currently used methods for the identification of known viruses include a variety of methods, from the cell culture by testing for presence of antigens, to molecular methods allowing for the amplification of nucleic acids. Molecular methods also include methods to identify new viruses or variants of viruses undetectable by standard methods. The most sensitive method for the identification of viruses is the use of universal primers in a standard amplification of nucleic acids.
The methodology uses the presence of solid, conservative sites in the genomes of viruses belonging to a single family. The use of such sites for primer design brings a hope that in the case of unknown viruses, these fragments will also be present and it will be possible the amplification and identification of new viruses and new variants of known viruses. The biggest disadvantage of this method is its effectiveness limited to viruses that have the same elements with a length of 18-25 nucleotides, which indicates their relationship. Some convenience in this case is CODEHOP method that allows the use of protein fragments and conservative design of highly degenerative primers.

The invention relates to a new method for the identification of RNA viruses involving the use of short 6-8 nucleotide DNA elements, as the attachment sites of specific primers in PCR reaction in a reverse transcription reaction. Method also includes the synthesis of the second strand of DNA, which allows for the addition to the nucleic acid fragment of the synthetic adapters allowing for subsequent amplification of the genetic material of RNA viruses. This is a modification of a currently applicable  standard PCR reaction.

The main advantage of this method is a significant reduction of conserved locations neccessary to amplify the nucleic acid as compared to a standard PCR reaction using the universal primers. The resulting products can be analyzed, for example, using size analyses (for example, agarose or polyacrylamide gel) or the use of sequencing.

The other advantages of the proposed method are:

• the possibility of applying this method in identification of the viral RNA
  in clinical samples;
• higher specificity compared to currently used methods PCR using universal primers;
• ease of implementation.

More information:

PhD Klaudia Polakowska                           tel. +48 12 663 3832, fax: 12 663 3831

Technology Transfer Officer                        e-mail: klaudia.polakowska@uj.edu.pl

CITTRU, Jagiellonian University

www.cittru.uj.edu.pl