Metoda określania przynależności gatunkowej oraz stopnia pokrewieństwa szczepów z rodzaju staphylococcus

(PROJEKT NR P-194)

Gronkowce (Staphylococcus) to jedne z najważniejszych patogenów bakteryjnych człowieka. Bakterie te są odpowiedzialne za wiele chorób oraz kolonizację skóry i śluzówek. W ostatnich latach opracowano i rozwinięto wiele metod identyfikacji oraz typowania izolatów bakterii z rodzaju Staphylococcus (gronkowiec). Wśród tych metod można wyróżnić dwie grupy: metody fenotypowe i genotypowe. Identyfikacja gatunków gronkowcowych metodami fenotypowymi oparta jest na charakterystyce morfologicznej, właściwościach fizjologicznych oraz chemicznym składzie ściany komórkowej. Rezultaty otrzymywane za pomocą komercyjnych testów opartych na profilach reakcji biochemicznych oraz immunologicznych obarczone są pomyłkami z powodu zmiennej ekspresji niektórych cech fenotypowych oraz dwuznaczności w interpretacji wyników. Ogólna dokładność konwencjonalnych testów jest niska i mieści się w przedziale 50-70%.

Spośród genotypowych metod porównawcza hybrydyzacja DNA-DNA oraz analiza sekwencyjna genu kodującego 16S rRNA zdefiniowały gatunki w obrębie rodzaju Staphylococcus oraz rekomendowane są dla potwierdzenia wyników nowych metod, które wprowadzane są do powszechnego użycia. Do innych metod identyfikacji genetycznych należą min. sondy genetyczne, hybrydyzacja typu dot-blot, amplifikacja metodą PCR i PCR gatunkowo-specyficzny (selektywny), PCR-RFLP – analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych. Do tej pory brak jest uniwersalnych metod jednoczesnej identyfikacji i typowania, stosowanych we wszystkich laboratoriach i pozwalających uzyskiwać wysoką powtarzalność wyników. Ustalenie zróżnicowania taksonomicznego wewnątrz rodzaju Staphylococcus nie jest łatwe i obecnie wyodrębnia się więcej niż 38 gatunków, opierając się na sekwencjonowaniu genu kodującego 16S rRNA. Na dzień dzisiejszy nie znaleziono również konsensusu, którą z nich można uznać za najlepszy standard.

Przedmiotem oferty jest nowe wykorzystanie locus genomowego hyptf w diagnostyce mikrobiologicznej, a w szczególności do określania przynależności gatunkowej oraz analizy różnorodności wewnątrzgatunkowej szczepów bakterii w obrębie rodzaju Staphylococcus. Przykładowo może ono opierać się na wykorzystaniu reakcji PCR (ang. polymerase chain reaction) do otrzymywania produktu na matrycy konserwatywnego locus genomowego, trawienia tego produktu enzymami restrykcyjnymi oraz analizy powstałego obrazu (RFLP, ang. restriction fragments length polymorphism) w celu determinacji przynależności gatunkowej. Analiza RFLP z odpowiednio dobranymi enzymami restrykcyjnymi pozwala również na analizę wewnątrzgatunkowej zmienności w obrębie rodzaju Staphylococcus.

Do podstawowych zalet nowej metody należą:

• unikalny wzór zmienności genu hyptf;
• możliwość otrzymania obrazów restrykcyjnych dla 4 różnych enzymów charakteryzujących się wysoką jednoznacznością i powtarzalnością;
• możliwość łatwej interpretacji wyników nawet w przypadku pojawienia się polimorfizmów wewnątrzgatunkowych;
• możliwość różnicowania nawet bardzo blisko spokrewnionych gatunków takich jak S. delphini, S. intermedius i S. pseudintermedius.

Oferowana metoda określania stopnia pokrewieństwa szczepów z rodzaju Staphylococcus stanowi przedmiot zgłoszenia patentowego. Dalsze prace nad jej rozwojem są prowadzone na Wydziale Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii,
a Centrum Innowacji, Transferu Technologii i Rozwoju Uniwersytetu poszukuje podmiotów zainteresowanych komercyjnym wykorzystaniem wynalazku.

Dalsze informacje:

dr Klaudia Polakowska                                     tel. 12 663 3832, fax: 12 63 3831

Specjalista ds. Transferu Technologii           e-mail: klaudia.polakowska@uj.edu.pl

CITTRU, Uniwersytet Jagielloński

www.cittru.uj.edu.pl

 ____________________________________________________________________________________________________

A method for species identification and determination
of phylogenetic relationships in the genus Staphylococcus

(PROJECT NR P-194)

Staphylococci (Staphylococcus) are one of the most important human bacterial pathogens. These bacteria are responsible for many diseases and the colonization of the skin and mucous membranes. Many methods have been developed for the identification and typing of bacterial isolates of the genus Staphylococcus (Staphylococcus aureus) in recent years. These methods can be divided into two groups: phenotypic and genotypic methods. The phenotypic identification of staphylococcal species is based on the morphological, physiological features and the chemical composition of the bacterial cell wall. The results obtained using commercial tests, which are based on biochemical and immunological reactions profiles, are affected by mistakes due to variable expression of phenotypic features and the ambiguity from the interpreting the test results. The overall accuracy of conventional tests is low and it is in the range 50-70%.

Among genotypic methods, DNA-DNA hybridization and 16S rRNA gene sequence analysis have defined the species in the genus Staphylococcus and they are recommended to confirm the results of the new methods that are introduced into general use. Other methods of this kind include genetic probes, dot-blot hybridisation, PCR amplification (Polymerase Chain Reaction), species-specific PCR (selective) and PCR-RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism analysis of PCR). However, there is still no universal method for staphylococcal species identification and typing at the same time, which would be widely used in all laboratories and allow to obtain high reproducibility of the results. Determination of taxonomic diversity in the genus Staphylococcus is complex, and there are currently more than 38 species, based on the sequencing of the gene encoding 16S rRNA. There is still no agreement as to which method can be taken as standard.

The subject of the offer is a new use of a genomic hyptf locus in microbiological diagnostics, in particular, to determine the species identification
and determination of phylogenetic relationships in the genus Staphylococcus.
As an example, the approach can be based on use of PCR (Polymerase Chain Reaction) on the template of conservative genomic locus to obtain a product, digestion of product with restriction enzymes and analysing of the resulting image (RFLP, Restriction Fragments Length Polymorphism) for the species identification. RFLP analysis with appropriately selected restriction enzymes also allows for analysis of intraspecies variability in the genus Staphylococcus.

The main advantages of a new method are:

• a unique pattern of hyptf gene variation;
• the possibility of obtaining RFLP images of four different restriction enzymes with a unique and reproducible pattern;
• the ability to easy interpret the test results, even in the case
  of the intraspecific polymorphisms;
• the possibility to differentiate between even very closely related species such as S. delphini, S. intermedius and S. pseudintermedius.

The offered method of species identification and determination of phylogenetic relationships in the genus Staphylococcus is the subject of a patent application. Further research and development of the invention are continued at the Faculty
of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology of the Jagiellonian University. Currently the Centre for Innovation, Technology Transfer and University Development (CITTRU) is looking for entities interested in commercial application
of the invention.

More information:

PhD Klaudia Polakowska                             phone. 12 663 3832, fax: 12 63 3831

Technology Transfer Officer                        e-mail: klaudia.polakowska@uj.edu.pl

CITTRU, Jagiellonian University

www.cittru.uj.edu.pl