Nowy sposób otrzymywania pochodnych chlorofilu

z wykorzystaniem modyfikowanych genetycznie bakterii

 (PROJEKT NR P-140)

Chlorofilaza jest enzymem występującym we wszystkich organizmach roślinnych, a jej funkcją jest biodegradacja chlorofilu poprzez hydrolizę wiązania estrowego w cząsteczce tego barwnika. Reakcja ta prowadzi do przekształcenia hydrofobowych chlorofili w rozpuszczalne w wodzie pochodne, zwane chlorofilidami. Aktywność enzymatyczna chlorofilazy znalazła zastosowanie w otrzymywaniu preparatów do terapii fotodynamicznej (PDT), w której rozpuszczalne w wodzie pochodne chlorofili i bakteriochlorofili są wykorzystywane jako leki fotouczulające (fotosensybilizatory). Ponadto znane są zastosowania chlorofilazy do odbarwiania olejów roślinnych poprzez usuwanie chlorofili.

Praktyczne zastosowanie chlorofilazy jest trudne, bowiem enzym ten jest to białkiem błonowym całkowicie nierozpuszczalnym w wodzie. Zwykle chlorofilazę otrzymuje się z liści lub komórek roślinnych, które wpierw przeprowadza się do postaci tzw. proszku acetonowego. Następnie enzym zostaje odtworzony w roztworze detergentu lub w mieszaninie rozpuszczalnika organicznego z wodą. Problemem jest jednak niewielka dostępność odpowiedniego materiału roślinnego, a także fakt, że preparat enzymu ulega denaturacji i może zostać wykorzystany tylko jednorazowo.

Nowa metoda opiera się na wykorzystaniu zmodyfikowanego genetycznie szczepu bakterii Escherichia coli i polega na otrzymaniu bakteryjnego proszku acetonowego zawierającego enzymy roślinne. Za pomocą metod genetyki molekularnej otrzymane zostały komórki bakterii zawierające wybrane geny rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) kodujące enzymy z grupy chlorofilaz. Nowy szczep bakterii hoduje się w standardowych warunkach, a następnie zawiesza w acetonie i suszy aż do uzyskania proszku. Otrzymany preparat posiada wysoką aktywność katalityczną, można go z powodzeniem przechowywać w stanie zamrożonym i wielokrotnie wykorzystać do enzymatycznej modyfikacji chlorofili i bakteriochlorofili. Tym samym wynalazek stanowi nową metodę otrzymywania rozpuszczalnych w wodzie pochodnych chlorofili i bakteriochlorofili na skalę preparatywną.

Opracowany proces wykorzystania chlorofilazy produkowanej w bakterii E. coli jest szczególnie korzystny i użyteczny ze względu na:

• nieograniczoną dostępność źródła enzymu,
• wydajną produkcję enzymu o wysokiej aktywności,
• nie ma potrzeby izolacji lub rekonstytucji enzymu – w reakcji enzymatycznej wykorzystywany jest bezpośrednio proszek acetonowy,
• możliwość wielokrotnego wykorzystania preparatu enzymu,
• możliwość wytwarzania pochodnych chlorofili na większą skalę niż w dotychczas stosowanych metodach.

W nowej metodzie wykorzystano system ekspresyjny Escherichia coli BL21. Otrzymane zostały dwa szczepy, nazwane BL21-CLH1 i BL21-CLH2, które zawierają odpowiednio geny AtCLH1 i AtCLH2 kodujące chlorofilazy Arabidopsis thaliana. Substratami enzymu AtCLH1 mogą być wyłącznie natywnie występujące chlorofile w konfiguracji S, a reakcje katalizowane przez to białko przebiegają z zachowaniem stereospecyficzności produktów. Natomiast chlorofilaza AtCLH2 nie wykazuje stereospecyficzności i katalizuje przemiany cząsteczek w konfiguracji R i S. Pozwala to na otrzymanie wielu różnych pochodnych chlorofili w skali preparatywnej.

Oferowane rozwiązanie zostało stworzone na Wydziale Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego i jest przedmiotem zgłoszenia patentowego. Obecnie Centrum Innowacji, Transferu Technologii i Rozwoju Uniwersytetu poszukuje podmiotów zainteresowanych wykorzystaniem opisanego wynalazku.

Dalsze informacje:

dr Klaudia Polakowska                                     tel. 12 663 3832, fax: 12 63 3831

Specjalista ds. Transferu Technologii           e-mail: klaudia.polakowska@uj.edu.pl

CITTRU, Uniwersytet Jagielloński

www.cittru.uj.edu.pl

____________________________________________________________________________________________________

A new method of obtaining chlorophyll derivatives
using genetically modified bacteria

(PROJECT No. P-140)

Chlorophyllase (Chlase) is an enzyme which occurs in all plants and functions in biodegradation of chlorophyll by hydrolysis of an ester bond in the molecule of this pigment. This reaction leads to transformation of hydrophobic chlorophylls into water-soluble chlorophyllides. Chlase enzymatic activity has been utilised to produce formulations for photodynamic therapy (PDT), in which water-soluble derivatives of chlorophylls and bacteriochlorophylls are used as photosensitizing drugs. There are also applications of Chlase in de-colourisation of plant oils by removing chlorophylls and their derivatives.

Practical application of Chlase is problematic, because it is a membrane protein insoluble in water. Usually, Chlase is obtained from the leaves or plant cells, which have been processed into acetone powder, from which it can be reconstituted into detergent solution or aqueous organic solvents. There are, however, several practical limitations to this method, including low availability of suitable plant material and the fact that the reconstituted enzyme undergoes denaturation and can be used only once.

The new method employs a genetically modified strain of Escherichia coli and is based on obtaining powder that contains the expressed plant enzyme. The modified bacterial strain is cultured under standard conditions. The enzymatic preparation has high catalytic activity, can be stored at low temperatures and repeatedly used for enzymatic modification of chlorophylls and bacteriochlorophylls. Thus, the invention provides a novel catalytic method for obtaining water-soluble derivatives of chlorophylls and bacteriochlorophylls on a preparative scale.

The process that utilizes Chlase produced in E. coli is advantageous and useful because of:

• unlimited availability of the enzyme source,
• efficient production of the enzyme having high activity,
• no isolation or reconstitution steps needed,
• multiple use of the enzyme preparation possible,
• the method facilitates highly efficient production of water-soluble chlorophyll derivatives on a much larger scale than previously used methods.

The new method uses the Escherichia coli BL21 expression system. Two different strains have been obtained, named as BL21-CLH1 and BL21-CLH2, which contain genes AtCLH1 and AtCLH2 encoding chlorophyllases of Arabidopsis thaliana. Only natively occurring chlorophylls in the S configuration are the substrates for AtCLH1 and the reactions catalyzed by this protein maintain product stereospecificity. On the other hand, AtCLH2 chlorophyllase do not exhibit stereospecificity and catalyzes conversion of substrates in both the R and S configuration. This allows to obtain various chlorophyll derivatives in preparative scale.

The offered solution has been invented at the Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology of the Jagiellonian University and is subject to a patent application. Currently the Centre for Innovation, Technology Transfer and University Development (CITTRU) is searching for companies and institutions interested in application of the technology described above.

More information:

PhD Klaudia Polakowska                             phone. 12 663 3832, fax: 12 63 3831

Technology Transfer Officer                        e-mail: klaudia.polakowska@uj.edu.pl

CITTRU, Jagiellonian University

www.cittru.uj.edu.pl