Candida freyschussii to przedstawiciel grzybów workowych należących do rzędu Saccharomycetales, zaliczany do popularnych „drożdży”. Klasyfikowany jest do mikroorganizmów heterotroficznych, a ściślej – do drożdży oleistych, zdolnych do akumulacji dużej ilości obojętnych lipidów. Materiał ten odkłada się w wyspecjalizowanych wewnątrzkomórkowych kompartymentach, znanych jako ciałka lipidowe. Ta szczególna cecha tego gatunku grzyba postawiła go w potencjalnej roli producenta biopaliwa.
Biodiesel to nic innego, jak mieszanka estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FA), pochodzących z transestryfikacji triacylogliceroli (TAG). W obliczu kurczących się zasobów paliw kopalnych, paliwo pochodzące z olejów roślinnych jawi się jako doskonała alternatywa dla kosztownych i nieodnawialnych rezerwuarów. Okazało się, że kompozycja triacylogliceroli wytwarzanych przez drożdże przypomina w dużym stopniu te roślinne, a przeprowadzenie reakcji transestryfikacji z ich udziałem odniosło sukces.
Z ekonomicznego punktu widzenia, aby realizacja projektu biopaliwowego była opłacalna, należy uwzględnić wykorzystanie jak najtańszego substratu. Dlatego surowy glicerol okazał się trafnym punktem wyjścia jako odpad poprocesowy. W skład tej mieszaniny wchodzi glicerol, metanol, mydła oraz składniki mineralne. Wszystkie te elementy zapewniają znaczne zyski w postaci dużej ilości biomasy i wysokiego końcowego stężenia lipidów. Brak konieczności oczyszczania pozostałości poprodukcyjnych dodatkowo udoskonala wizję wykorzystania surowego glicerolu, zważywszy na koszty takiego procesu.
Zanim wyłoniono jeden najbardziej interesujący szczep drożdży, przeprowadzono cały szereg doświadczeń, czyli screening 33 ich rodzajów (należących aż do 19 gatunków) na zdolność do wzrostu i produkcji lipidów wewnątrzkomórkowych. Badane linie grzybów hodowano na podłożu GMY zawierającym 40 g/l glicerolu oraz 3g/l ekstraktu drożdżowego. Pożywka ta odznacza się więc wysokim stosunkiem węgla do azotu. Takie proporcje wystarczały do akumulacji lipidów zapasowych pod warunkiem, że badane drożdże należały do oleistych. Mniejszość z analizowanych szczepów zużywała większą część glicerolu i generowała widoczne ciałka lipidowe.
Skład stosowanego podłoża nie pozostawał bez wpływu na wzrost rosnących na nim organizmów. Niektóre linie drożdży cechowały się wyższą żywotnością, przebywając na surowym, odpadkowym glicerolu w porównaniu do oczyszczonego. Zastosowanie surowej gliceryny skutkuje niższym stresem osmotycznym w porównaniu do czystej, a ponadto odpadowa zawiera składniki odżywcze przyspieszające wzrost albo przydatne w produkcji biomasy czy złożonych lipidów, np. wolne kwasy tłuszczowe. Pozytywnie w wytwarzanie biomasy angażują się również sole nieorganiczne, glicerydy i mydła obecne w nieoczyszczonej glicerynie.
Celowa nierównowaga w składzie pożywki stosowanej do hodowli Candida indukuje w ich komórkach lipogenezę. Dzieje się tak wskutek znaczącego ograniczenia źródła azotu kosztem węgla. Jednakże zbyt duża ilość glicerolu wywołuje stres osmotyczny przyczyniający się do zahamowania wzrostu. Niedobór azotu wprawdzie inhibitował podziały komórkowe, ale z drugiej strony odpowiadał za wzrost ilości biomasy i lipidów wewnątrzkomórkowych. Zwiększenie wagi biomasy następowało wskutek równoczesnej akumulacji tłuszczów i węglowodanów. Obserwacje te wynikają z eksperymentów nad hodowlami okresowymi. Ostatecznie wyselekcjonowano jeden szczep (C. freyschussii ATCC 18737), gdyż wykazywał najintensywniejszą produkcję lipidów oraz najwyższą wydajność konwersji glicerolu.
Po przeanalizowaniu uzyskanych ekstraktów lipidowych metodą NMR okazało się, że ich skład odpowiada w znacznej mierze tym roślinnym. Właściwości fizykochemiczne biodiesla złożonego z estrów metylowych kwasów tłuszczowych z C. freyschussii przypominają te charakteryzujące biopaliwo z oleju rzepakowego i palmowego. Zarazem spełniają więc ustalone normy amerykańskie i europejskie. Wobec tego stało się oczywiste, że materiał wygenerowany przez drożdże znajdzie podobne zastosowanie, jak ten roślinny.
Podsumowując, C. freyschussii można uznać za interesujący mikroorganizm do wykorzystania w branży biopaliwowej. Pośród powszechnej bioróżnorodności nadal izoluje się i bada inne oleiste gatunki zdolne do zwaloryzowania odpadów pochodzących z produkcji biodiesla. Zadaniem do wykonania w przyszłości wciąż pozostaje dostosowanie warunków hodowli półciągłej do użycia surowej gliceryny jako pożywki.
Magdalena Małachowska
