Elektroforeza to jeden z najprostszych sposobów oceny wielkości badanego preparatu: prędkość migracji kwasów nukleinowych w żelu jest odwrotnie proporcjonalna do ich długości. Dzięki zastosowaniu bromku etydyny, który interkaluje pomiędzy zasady azotowe w DNA lub RNA, możliwa jest wizualizacja tych kwasów w świetle UV. W celu oceny wielkości i jakości badanego preparatu porównuje się prędkość migracji oraz intensywność odpowiadających mu fluoryzujących „prążków” z równocześnie poddanym elektroforezie preparatem porównawczym, o znanym stężeniu.
Drugim sposobem oznaczenia stężenia jest pomiar absorbancji przy długości fali 260 nm, przy odniesieniu do odpowiednich proporcji: absorwancja ma wartość 1 dla dwuniciowego DNA o stężeniu 50 µg/ml, dla jednoniciowego DNA o stężeniu 33 µg/ml lub dla RNA o stężeniu 40 µg/ml. Co więcej, pomiar absorpcji w większym zakresie fal pozwala na ocenę jakości preparatu, ponieważ stosunek wartości absorpcji dla kilku różnych długości fali pozwala ocenić stopień zanieczyszczenia białkami, RNA lub DNA czy też innymi substancjami stosowanymi podczas izolacji kwasów nukleinowych.
Obecnie najczęściej stosowanymi spektrofotometrami są urządzenia typu NanoDrop, które charakteryzują się wysoką dokładnością pomiarów. W celu oznaczenia stężenia i jakości wyizolowanego kwasu nukleinowego nie trzeba nawet rozcieńczać próby – wystarczy nanieść na czytnik kroplę preparatu o objętości rzędu 1 µl, a już w ciągu kilku sekund otrzymamy wynik pomiaru łącznie z widmem absorpcji dla wybranego zakresu długości fal. Ma to duże znaczenie zwłaszcza wtedy, gdy objętość wyizolowanego materiału jest niewielka, a znajomość stężenia oraz stopnia czystości kwasu niezbędna w celu wykonania dalszych manipulacji. Łatwość obsługi tego urządzenia jest szczególnie przydatna podczas prowadzenia wielu pomiarów jednocześnie dla całej serii preparatów – wystarczy w takim przypadku jedynie wykalibrować spektrofotometr przy użyciu buforu elucyjnego, stosowanego podczas izolacji. Szeroki zakres widma pozwala także na pomiary innego typu, takie jak stężenia peptydów i oczyszczonych białek czy też badanie gęstości optycznej.
źródło: http://www.nanodrop.
Magdalena Sokulska
