Nowa metoda wydajnej izolacji DNA patogenów z krwi

(PROJEKT NR P-168)

Mikrobiologiczna diagnostyka krwi jest jednym z najbardziej problematycznych wyzwań diagnostycznych. Obecność we krwi bakterii (bakteriemia) lub grzybów (fungemia) bardzo często skutkuje sepsą, czyli ogólnoustrojowym stanem zapalnym wywołanym zakażeniem. Sepsa stanowi jeden z najbardziej palących problemów współczesnej medycyny. Śmiertelność powodowana przez zakażenia krwi o etiologii bakteryjnej czy grzybiczej jest duża: w USA z powodu sepsy umiera rocznie ponad 200 tys., w Unii Europejskiej – ok. 150 tys. osób. Ponadto nawet w krajach rozwiniętych sepsa pojawia się u 2-4/1000 noworodków, co jest ona główną przyczyną ich śmierci.

W leczeniu zakażeń krwi najważniejszym i najtrudniejszym problemem decydującym o skuteczności terapii i, w konsekwencji, o kosztach i czasie hospitalizacji jest skuteczna diagnostyka czynników wywołujących ogólnoustrojową odpowiedź zapalną w przebiegu sepsy. Oznaczenie czynnika etiologicznego pozwala na dobranie odpowiedniej, celowanej antybiotykoterapii. Materiałem poddawanym badaniu diagnostycznemu jest krew pobrana od pacjenta wykazującego objawy kliniczne sepsy. Obecnie „złotym standardem” diagnostycznym jest metoda hodowli drobnoustrojów obecnych we krwi, prowadzona na specjalnych podłożach specyficznych dla określonych grup patogenów. Metoda ta jest stosunkowo prosta i niedroga, ale też czasochłonna – oczekiwanie na wynik może sięgać 5 dni. Ponadto identyfikacja patogenów tą metodą często zawodzi ze względu na niską czułość i jedynie w ok. 15-20% hodowli udaje się uzyskać wzrost mikroorganizmów.

W celu poprawienia wykrywalności czynników mikrobiologicznych we krwi rozwijane są molekularne metody detekcji oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR, ang. Polymerase Chain Reaction). Ich czułość znacznie przewyższa czułość metody hodowlanej, a ponadto na wynik badania nie ma wpływu wcześniejsze zastosowanie antybiotykoterapii. Pozwala to wdrożyć leczenie natychmiast, jeszcze przed pobraniem próbek krwi do analizy. Niestety, metody biologii molekularnej również wykazują ograniczenia. Trudność sprawia wyizolowanie matrycy DNA o odpowiedniej jakości i wysokim stężeniu. Komórki bakterii i grzybów charakteryzują się zróżnicowaną podatnością na lizę, która jest niezbędnym etapem pozyskania z nich DNA. W przypadku bakterii ściana komórkowa u gatunków z grupy bakterii Gram dodatnich jest grubsza i oporna na degradację, co powoduje konieczność zastosowania specjalnej lizy enzymatycznej. Z kolei ściana komórkowa grzybów wykazuje zupełnie odmienny skład chemiczny niż ściana bakteryjna, a standardowe postępowanie stosowane w przypadku bakterii zawodzi. Ponadto grzyby drożdżopodobne różnią się budową ściany komórkowej od grzybów pleśniowych, co znacznie komplikuje proces izolacji DNA.

Diagnostykę molekularną komplikuje również obecność we krwi hemu, który jest silnym inhibitorem polimeraz DNA używanych w metodzie PCR. Większość dostępnych procedur preparatyki krwi nie pozwala na całkowite usunięcie efektu hamowania reakcji PCR, co w konsekwencji może prowadzić do uzyskania wyniku fałszywie negatywnego. Istnieją co prawda sposoby na ograniczenie hamującego wpływu hemu na tę reakcję, m.in. z użyciem albuminy wołowej, glicerolu czy dekstranu, jednak powodują one zmniejszenie czułości metody PCR i ograniczenie jej skuteczności diagnostycznejPrzedmiotem oferty jest nowy sposób izolowania DNA drobnoustrojów z krwi, mający na celu uzyskanie wysokiej jakości matrycy do reakcji PCR. Prezentowana metoda może być stosowana w pełnej wersji, w wyniku której izoluje się jednocześnie DNA bakterii i grzybów, jak również w wariantach ograniczonych, w celu uzyskania tylko DNA bakterii lub tylko DNA grzybów.

Podstawowe zalety proponowanej metody to:

• połączenie lizy enzymatycznej, mechanicznej oraz termicznej,
• zmniejszenie do minimum stężenia hemu w próbce, dzięki czemu reakcja PCR nie jest hamowana,
• brak konieczności używania specjalnych chemicznych protektorów polimerazy DNA,
• zwiększenie czułości detekcji mikroorganizmów we krwi (detekcja już od 100 CFU/ml krwi),
• uproszczona metodyka izolacji DNA,
• zmniejszenie kosztów metody.

Oferowana metoda izolacji DNA stanowi przedmiot zgłoszenia patentowego. Dalsze prace nad rozwojem metod diagnostyki molekularnej są prowadzone w Katedrze Mikrobiologii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego, a Centrum Innowacji, Transferu Technologii i Rozwoju Uniwersytetu poszukuje podmiotów zainteresowanych komercyjnym wykorzystaniem wynalazku.

Dalsze informacje:

dr Klaudia Polakowska                                     tel. 12 663 3832, fax: 12 663 3831

Specjalista ds. Transferu Technologii           e-mail: klaudia.polakowska@uj.edu.pl

CITTRU, Uniwersytet Jagielloński

 ____________________________________________________________________________________________________

New method for efficient isolation of microbial DNA from blood

(PROJECT No. P-168)

Microbiological diagnosis of blood is one of the most problematic diagnostic challenges. The presence of bacteria (bacteremia) or fungi (fungemia) in the blood very often results in sepsis – systemic inflammation caused by the infection. Sepsis is one of the most pressing problems of modern medicine. Mortality caused by sepsis of bacterial or fungal etiology is high: in the U.S. more than 200 000 people die each year due to sepsis, and there are further 150 000 fatal cases in the European Union. Moreover, even in the developed countries sepsis occur in 2-4 newborns per 1000 and it is the main cause of newborn death.

The most important and most difficult problem in the treatment of bloodstream infections, determining the effectiveness of therapy and, consequently, the cost and time of hospitalization, is the effective diagnosis of factors responsible for the systemic inflammatory response in the course of sepsis. Determination of etiologic factors allows for selection of appropriate antibiotic therapy. The material subjected to diagnostic testing is blood taken from the patient showing clinical signs of sepsis. Currently, the "gold standard" diagnostic method is testing for microbial growth after inoculation in culture media specific to selected pathogen groups. This method is relatively simple and inexpensive, but also time-consuming – results can be available as late as in 5 days. Moreover, identification of pathogens with this method often fails due to low sensitivity; microbial growth can be detected in only about 15-20% of the cultures.

Detection of microbiological agents in blood can be improved using molecular detection methods based on polymerase chain reaction (PCR). Sensitivity of those methods is much higher than in the case of the culture methods, while the diagnostic results are not affected by prior use of antibiotics. This allows for immediate introduction of the treatment, even before blood sampling for analysis. Unfortunately, the methods of molecular biology also have limitations. The difficulty is to isolate DNA template of adequate quality and high concentration. The cells of bacteria and fungi show different susceptibility to lysis, which is a prerequisite for obtaining DNA from them. In the case of bacteria, the cell wall of the species from the Gram-positive group is thicker and resistant to degradation, which makes it necessary to use special enzymatic lysis. The fungal cell wall, on the other hand, has completely different chemical composition than the bacterial wall, so standard procedures used with bacteria fail. In addition, the cell walls of yeast-like fungi and mould fungi are structurally different, which greatly complicates the process of DNA isolation.

Molecular diagnostics is also impaired by the heme present in the blood, which is a potent inhibitor of DNA polymerases used in the PCR method. Most of the blood processing procedures available does not allow for the complete elimination of the PCR inhibition effect, which in turn may lead to a false negative diagnostic result. There are ways to reduce the inhibitory effect of heme on the reaction, such as using bovine serum albumin, glycerol or dextran, but they reduce PCR sensitivity and limit its diagnostic usefulness.The offer a novel method for the isolation of microbial DNA from blood, capable to produce high quality template for PCR. The presented method can be used in full mode, in which both bacterial and fungal DNA is isolated, or in limited modes that allow for obtaining DNA only from bacteria or only from fungi.

The main advantages of the offered method are:

• combination of enzymatic, mechanical and thermal lysis,
• minimising heme concentration in the sample, so that the PCR reaction is not inhibited,
• no need to use special chemical protectors DNA polymerase,
• increased sensitivity of micro-organism detection in the blood (detection from 100 CFU/ml of blood),
• simplified DNA isolation method,
• reduced costs.

The offered method of DNA isolation is patent pending. Further work on the development of molecular diagnostic methods are carried out in the Department of Microbiology, Jagiellonian University Medical College, while the Centre for Innovation, Technology Transfer and University Development is looking for partners interested in commercial use of the invention.

More information:

PhD Klaudia Polakowska          phone: +48 12 663 38 32, fax: +48 12 663 38 31

Technology Transfer Officer       e-mail: klaudia.polakowska@uj.edu.pl
CITTRU, Jagiellonian University