Metoda detekcji bakterii i grzybów w preparacie biologicznym metodą pcr

(PROJEKT NR P-192)

Zakażenia wywoływane przez bakterie i grzyby od zawsze stanowiły poważny problem medyczny. Najgroźniejszym z nich jest zakażenie ogólnoustrojowe czyli sepsa. Paradoksalnie, w miarę rozwoju wiedzy medycznej i wprowadzania coraz to nowszych procedur terapeutycznych, zapadalność na sepsę wzrasta. W USA w ciągu roku na sepsę zapada 750 tys. osób i jest ona przyczyną ponad 215 tys. zgonów. Z kolei w Unii Europejskiej z powodu ciężkiej sepsy umiera rocznie 146 tys. chorych.

W leczeniu zakażeń krwi najważniejszym i najtrudniejszym problemem decydującym o skuteczności terapii i w konsekwencji o kosztach i czasie hospitalizacji jest skuteczna diagnostyka czynników wywołujących ogólnoustrojową odpowiedź zapalną w przebiegu sepsy. Materiałem poddawanym badaniu diagnostycznemu jest krew pobrana od pacjenta z objawami klinicznymi sepsy. Największą trudnością jest bardzo mała ilość mikroorganizmów odpowiedzialnych za zakażenie i znajdujących się we krwi, lub też następuje tylko ich okresowy wysiew do krwi.

Obecnie standardem diagnostycznym są hodowle krwi prowadzone na specjalnych podłożach, najlepiej w systemach hodowli automatycznej. Słabą stroną tych metod jest czasochłonność (do czasu wydania wyniku badania) oraz niska czułość, która powoduje że jedynie w około 15-20% hodowli udaje się uzyskać wzrost mikroorganizmów. Sytuację dodatkowo pogarsza fakt poddawania pacjentów antybiotykoterapii zanim dojdzie do pobrania próbki krwi na posiew. Hodowle krwi w takim wypadku są bardzo utrudnione z uwagi na to, iż znajdują się w niej antybiotyki hamujące wzrost mikroorganizmów.

Do metod diagnostycznych, które umożliwiają skuteczną, precyzyjną i szybką diagnostykę zakażeń krwi należą techniki biologii molekularnej takie jak PCR czy hybrydyzacja. Czułość tych metod znacznie przewyższa czułość metod hodowlanych. Jednakże obecnie dostępne systemy umożliwiają wykrywanie kilkunastu konkretnych gatunków drobnoustrojów, lub pozwalają na detekcję teoretycznie każdego możliwego gatunku, ale wymagane jest sekwencjonowanie produktu PCR, co zwiększa z kolei koszty oraz wydłuża czas oczekiwania na wynik.

Przedmiotem wynalazku jest nowa metoda detekcji bakterii i grzybów w próbce materiału biologicznego, w którym zawarte DNA poddaje się amplifikacji w reakcji PCR w czasie rzeczywistym w systemie multipleksowym. Reakcję amplifikacji prowadzi się dwuetapowo z zastosowaniem w pierwszym etapie starterów specyficznych dla bakterii oraz grzybów, a następnie produkt pierwszej amplifikacji wykorzystuje się jako matrycę w drugim etapie – amplifikacji z zastosowaniem starterów i sond różnicujących grzyby na grupę grzybów pleśniowych i drożdżopodobnych i bakterie na Gram dodatnie i Gram ujemne.

Do podstawowych zalet proponowanej metody należą:

• objęcie całości panelu mikroorganizmów bakteryjnych i grzybiczych,
  z różnicowaniem na bakterie Gram ujemne, Gram dodatnie, grzyby drożdżopodobne i grzyby pleśniowe, lecz bez typowania konkretnych gatunków;
• jednoczesna amplifikacja co najmniej 2 sekwencji DNA, co pozwala
  na jednoczesną detekcję bakterii i grzybów, bez oczekiwania na wynik elektroforezy DNA;
• zastosowanie systemu Nested pozwala na zwiększenie czułości metody detekcji o dwa rzędy wielkości w porównaniu do PCR jednostopniowego;
• możliwość wykorzystania metody do wykrywania tylko bakterii lub tylko grzybów, lub do jednoczesnego wykrywania zarówno grzybów jak i bakterii, co wpływa na obniżenie kosztów badania.
• możliwość wytypowania konkretnego gatunku drobnoustroju
  po sekwencjonowaniu produktu PCR.

Oferowana metoda detekcji bakterii i grzybów w preparacie biologicznym stanowi przedmiot zgłoszenia patentowego. Dalsze prace nad jej rozwojem są prowadzone w Katedrze Mikrobiologii UJ CM, a Centrum Innowacji, Transferu Technologii
i Rozwoju Uniwersytetu poszukuje podmiotów zainteresowanych komercyjnym wykorzystaniem wynalazku.

Dalsze informacje:

dr Klaudia Polakowska                                    tel. 12 663 3832, fax: 12 663 3831

Specjalista ds. Transferu Technologii           e-mail: klaudia.polakowska@uj.edu.pl

CITTRU, Uniwersytet Jagielloński

www.cittru.uj.edu.pl

 ____________________________________________________________________________________________________

New PCR method FOR detection of BACTERIA AND FUNGI
IN Biological SAMPLE

(TECHNOLOGY OFFER P-192)

Bacterial and fungal infections have always been a serious medical problem. Sepsis is the most dangerous systemic infection. Paradoxically, despite the development of medical knowledge and the introduction of new therapeutic procedures into
the treatment, the incidence of sepsis is increasing. In the United States over 750 thousand people fall sepsis each year and it causes more than 215 thousand deaths. In the European Union there are more than 146 thousand deaths due to severe sepsis each year.

In the treatment of bloodstream infections the most important and difficult problem of determining the effectiveness of treatment and, consequently, the cost and time of hospitalization is the effective diagnosis of factors causing a systemic inflammatory response in sepsis. The material subjected to diagnostic testing is blood taken from a patient showing clinical signs of sepsis. The greatest difficulty is the very small amount of microorganisms being responsible for the infection in the blood, or they are only periodically seeded into the blood.

Currently, the standard diagnostic blood cultures are performed with specialized broth media, preferably in automatic culture systems. A weakness of these methods are time consumption (until a result of the study) and low sensitivity, which causes that in only 15-20% of the culture it is possible to achieve the growth of microorganisms. The situation is further complicated by the fact that patients undergo antibiotic treatment before a blood sample is taken for culture. In this case blood cultures are very difficult due to the fact that they contain antibiotics which inhibit the growth of microorganisms.

The molecular biology techniques, such as PCR or hybridization, belong to diagnostic methods that provide reliable, accurate and fast diagnosis of bloodstream infections. The sensitivity of molecular methods is much higher than the sensitivity of the culture method. However, currently available systems enable the detection of several particular species of microorganisms or every possible gene in theory, but on the other hand they require sequencing of PCR product, which in turn increases the cost and time for the result.

The offered invention relates to a new method for detection of bacteria and fungi in a sample of biological material, in which the contained DNA is amplified by real-time multiplex PCR system. An amplification is carried out in two stages. In the first stage there are used primers specific for bacteria and fungi. Then the product
of first amplification is used as a template in a second step – an amplification using primers and probes to differentiate yeast fungi and molds, Gram-positive
and Gram-negative bacteria.

The main advantages of the proposed method are:

• detection of the entire panel of bacterial and fungal microorganisms,
  with the differentiation of Gram-negative bacteria, Gram-positive bacteria, yeasts fungi and molds, but without typing a particular species;
• simultaneous amplification of at least two DNA sequences, which allows
  a simultaneous detection of bacteria and fungi, without waiting
  for the result of DNA electrophoresis;
• application of a nested-PCR system which allows for increased sensitivity
  of detection by two orders of magnitude compared to one-stage PCR;
• the possibility of using the detection method only for bacteria or fungi,
  or for the simultaneous detection of both fungi and bacteria, which reduces the cost of testing;
• the opportunity to identify a specific species of microorganism after sequencing of the PCR product.

The offered method of detection of bacteria and fungi is patent pending. Further research and development of the invention are continued at the Department of Microbiology, Jagiellonian University Medical College. Currently the Centre for Innovation, Technology Transfer and University Development (CITTRU) is looking for entities interested in commercial application of the invention.

More information:

PhD Klaudia Polakowska                           phone. 12 663 3832, fax: 12 663 3831

Technology Transfer Officer                       e-mail: klaudia.polakowska@uj.edu.pl

CITTRU, Jagiellonian University

www.cittru.uj.edu.pl