Sposób oczyszczania rekombinowanego ludzkiego białka PCNA nie posiadającego metki fuzyjnej

(PROJEKT NR P-199)

PCNA (ang. proliferating cell nuclear antigen), czyli jądrowy antygen komórek proliferujących jest to niehistonowe białko jądrowe. PCNA jest markerem proliferacji komórkowej i stanowi wykładnik nasilenia proliferacji w różnych typach nowotworów. PCNA jest czynnikiem potrzebnym polimerazie DNA typu delta nie tylko w procesie replikacji DNA, ale także podczas naprawy DNA. PCNA może być wykorzystywany jako jeden z markerów do oceny potencjału nowotworowego komórek, a także w diagnostyce wybranych chorób autoimmunologicznych.

Białka rekombinowane są to białka uzyskiwane metodami inżynierii genetycznej
i wyprodukowane w heterologicznych układach ekspresyjnych. Produkcja rekombinowanych białek to często jedyna lub najtańsza metoda otrzymywania homogennego preparatu enzymu, białka czy peptydu, pozwalająca na zbadanie jego struktury i funkcji, często jedyny sposób, żeby enzym produkowany na potrzeby medycyny był dobrze scharakteryzowany. Jeśli rekombinowane białko w wyniku wprowadzenia pożądanych zmian zachowuje prawidłową strukturę i funkcję wtedy może stanowić narzędzie w przemyśle, rolnictwie, przetwarzaniu żywności oraz biologii molekularnej. Żeby osiągnąć powyższe cele należy wyprodukowane w kontrolnych warunkach białko oczyścić jak najszybciej i z jak największą wydajnością.

W znanych heterologicznych systemach ekspresyjnych wykorzystywanych do nadekspresji oraz pozyskiwania białek rekombinowanych wykorzystywane są wektory posiadające metki fuzyjne np. His, GST lub MBP wykazujące powinowactwo odpowiednio do: jonu metalu (np. niklu), glutationu lub amylozy. Zastosowanie wymienionych metek umożliwia łatwe oraz szybkie uzyskanie pożądanego preparatu białkowego charakteryzującego się zazwyczaj wysokim stopniem czystości. Podejście takie z powodzeniem jest stosowane dla wielu białek m.in. dla białka PCNA. Niejednokrotnie specyfika prowadzonych badań wymaga korzystania z białka, które nie zawiera metki fuzyjnej. W takim przypadku możliwe są co najmniej dwa rozwiązania: odcięcie metki fuzyjnej, które nie jest zawsze możliwe albo oczyszczanie białka pozbawionego metki fuzyjnej klasycznymi metodami chromatograficznymi. Dostępne obecnie metody oczyszczania białka PCNA bez metki fuzyjnej opisują konieczność zastosowania co najmniej dwóch różnych złóż chromatograficznych np. hydrofobowego i jonowymiennego, fosfocelulozowego
i jonowymiennego lub jonowymiennego i heparynowego.

Przedmiotem oferty jest metoda oczyszczania rekombinowanego ludzkiego białka PCNA nie posiadającego metki fuzyjnej i poddanego nadekspresji w komórkach
E. coli. Kolejnym etapem metody jest wysalanie białka siarczanem amonu
z roztworu uzyskanych białek wewnątrzkomórkowych, a następnie rozdział wysolonej frakcji białkowej metodą chromatografii jonowymiennej.

Podstawowe zalety proponowanej metody oczyszczania białka PCNA to:

• uproszczona metodyka realizacji ponieważ bazując na dużej rozpuszczalności białka metoda ta wykorzystuje technikę wysalania siarczanem amonu,
  a następnie chromatografię na kolumnie jonowymiennej Q;
• wysoka wydajność;
• wysoka czystość i aktywność uzyskiwanego preparatu białkowego;
• zmniejszenie kosztów oraz czasu metody.

Oferowana metoda oczyszczania rekombinowanego ludzkiego białka PCNA nie posiadającego metki fuzyjnej stanowi przedmiot zgłoszenia patentowego. Dalsze prace nad jej rozwojem prowadzone na Wydziale Biochemii, Biofizyki
i Biotechnologii UJ, a Centrum Innowacji, Transferu Technologii i Rozwoju Uniwersytetu poszukuje podmiotów zainteresowanych komercyjnym wykorzystaniem wynalazku.

Dalsze informacje:

dr Klaudia Polakowska                                  tel. 12 663 3832, fax: 12 663 3831

Specjalista ds. Transferu Technologii           e-mail: klaudia.polakowska@uj.edu.pl

CITTRU, Uniwersytet Jagielloński

www.cittru.uj.edu.pl

 ____________________________________________________________________________________________________

A NEW METHOD FOR PURIFICATION OF PCNA RECOMBINANT HUMAN PROTEIN WITHOUT A FUSION TAG

 (TECHNOLOGY OFFER P-199)

The proliferating cell nuclear antigen (PCNA) is a non-histone nuclear protein. This protein is a necessary factor required not only in DNA replication, but also in DNA repair process. PCNA - a marker of cell proliferation may be used in evaluation
of the human cells tumorigenic potential, as well as in diagnosis of selected autoimmune diseases.

Recombinant proteins are obtained with the help of genetic engineering methods and produced in heterologous expression systems. Production of recombinant proteins is often one of the cheapest method to obtain a high quality protein
for structural and functional studies. If the recombinant protein retains the proper structure and function it may be a tool used in industry, agriculture, food processing, molecular biology and medicine. To achieve these objectives a protein produced under controlled conditions should be quickly purified with the maximum possible efficiency.

In well-known heterologous expression systems the production of recombinant proteins is based on the vectors coding for fusion tags e.g.: His, GST or MBP characterized by an affinity to: metal ion (e.g. nickel), glutathione or amylase respectively. These tags allow fast and easy purification of desired protein which is usually characterized by purity and activity. This approach has been successfully used for a number of proteins including PCNA protein. Very often the specificity
of conducted research requires the protein that does not contain a fusion tag.
In that case, there are at least two solutions: either fusion tag removal which is not always possible or purification of protein without a fusion tag using conventional chromatographic methods. The currently available methods for PCNA protein purification without a fusion tag describe the requirement for at least two different chromatographic resins, e.g. hydrophobic and ion exchange, phosphor-cellulose and ion exchange or ion exchange and heparin.

The subject of the offer is a new method for purification of PCNA recombinant human protein without a fusion tag overexpressed in Escherichia coli cells. Using ammonium sulfate the protein is precipitated from bacterial intracellular proteins solution, and then purified with the help of ion exchange chromatography.

The basic advantages of the offered method for purification of PCNA protein are:

• simplified methodology based on the high solubility of PCNA protein, this method uses the technique of ammonium sulfate precipitation, and then the ion exchange chromatography with column Q;
• high purity and activity of the obtained protein preparation;
• reductions of cost and time.

The offered method for purification of PCNA recombinant human protein without a fusion tag is a subject of a patent application. Further research and development of the invention are continued at the Faculty of Biochemistry, Biophysics
and Biotechnology of the Jagiellonian University. Currently the Centre for Innovation, Technology Transfer and University Development (CITTRU) is looking for entities interested in commercial application of the invention.

More information:

PhD Klaudia Polakowska                           phone. 12 663 3832, fax: 12 663 3831

Technology Transfer Officer                      e-mail: klaudia.polakowska@uj.edu.pl

CITTRU, Jagiellonian University

www.cittru.uj.edu.pl