Metody służące ocenie stopnia cytotoksyczności związków chemicznych wykorzystują szereg różnych parametrów związanych z fizjologią komórek, w stosunku do których badana jest aktywność danych substancji. Należą do nich np. integralność błony komórkowej, proliferacja, aktywność komórkowych enzymów metabolicznych, jak również ilość białka lub materiału genetycznego.
Metodą wykorzystującą zmiany w integralności błony komórkowej jest bezpośredni pomiar żywotności komórek po uprzednim wybarwieniu ich, najczęściej błękitem trypanu lub czerwienią obojętną. Odróżnienie komórek martwych od żywych związane jest z możliwością gromadzenia się barwnika w odpowiednim miejscu komórki.
Błękit trypanu nie wnika do cytoplazmy komórek. Gromadzi się w okolicach błony komórkowej. Czerwień obojętna przedostaje się natomiast do cytoplazmy na zasadzie transportu biernego i gromadzi się w lizosomach żywych komórek.
W celu zbadania aktywności cytotoksycznej związków o potencjalnym zastosowaniu medycznym można również wykorzystać tzw. pośrednie testy pomiarowe, które związane są z aktywnością niektórych enzymów komórkowych.
Wśród takich enzymów jest mitochondrialne białko - dehydrogenaza bursztynianowa. Do testów, które mają na celu określenie jej aktywności należą MTT lub MTS. Mitochondrialna dehydrogenaza przekształca pomarańczową, rozpuszczalną w wodzie sól tetrazolową (bromek 3-(4,5-dimetylo-tiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazolu) do formazanu. Produkt reakcji w teście MTT nie rozpuszcza się w wodzie, a zatem metoda ta wymaga zastosowania rozpuszczalników organicznych.
W przypadku zastosowania procedury MTS, produkt powstaje w obecności metosiarczanu fenazyny (PMS, ang. phenazine methosulfate) i jest w pełni rozpuszczalny w wodzie. Test MTS stanowi zatem nieco ulepszoną alternatywę dla testu MTT. Formazan jest substancją barwną, a intensywność jego zabarwienia może być zmierzona przy użyciu spektrofotometru. Należy zwrócić uwagę, że formazan powstaje jedynie w przypadku, gdy mamy do czynienia z żywymi komórkami.
Ilość tego związku pozwala zatem na szybkie i stosunkowo dokładne oszacowanie przeżywalności komórek w obecności określonego stężenia badanego związku. Podobną, kolorymetryczną metodą związaną z pomiarem absorbancji barwnego produktu reakcji enzymatycznej jest test LDH. W metodzie tej badana jest aktywność cytoplazmatycznego enzymu - dehydrogenazy mleczanowej. Zmiany w integralności błony komórkowej powodują, że dehydrogenaza wypływa do podłoża hodowlanego. Enzym ten przekształca znajdujące się w pożywce sole terazolowe w formazan. W odróżnieniu od testów MTT lub MTS, w tym przypadku powstawanie barwnego produktu związane jest jednak z wcześniejszą lizą komórki przez badany związek chemiczny.
Przeżywalność hodowli komórkowej można również określić wykorzystując tzw. test SRB. W metodzie tej wykorzystuje się anionowy barwnik - sulforodaminę B, który w odpowiednich warunkach pH wykazuje zdolność elektrostatycznego wiązania z białkami. Ilość białek, równoważna absorpcji sulforodaminy, jest bezpośrednim wyznacznikiem ilości żywych komórek w hodowli.
Uszkodzenia komórek, będące wynikiem toksycznego działania niektórych substancji, powodują zahamowanie syntezy materiału genetycznego.
Badania intensywności syntezy DNA dokonuje się poprzez zastosowanie analogów składowych kwasu deoksyrybonukleinowego - nukleozydów. Do takich analogów należą trytowana tymidyna ([H3]tymidyna) i bromodeoksyurydyna.
W pierwszym przypadku dokonuje się pomiaru scyntylacyjnego promieniowania β. Detekcja bromodeoksyurydyny odbywa się natomiast dzięki reakcji enzymu sprzężonego z przeciwciałem specyficznym w stosunku do chromogennego substratu. Proces syntezy DNA jest miarą zdolności proliferacyjnych badanych komórek, obrazuje zatem żywotność hodowli.
Bez względu na wybraną do badań metodę oceny cytotoksyczności związków o potencjalnym zastosowaniu medycznym, konieczna jest dokładna optymalizacja procedury badawczej. W celu uzyskania pełnego profilu cytotoksyczności danego związku w komórkach, doświadczenia przeprowadza się w oparciu o jego kilka różnych stężeń.
Za miarę aktywności cytotoksycznej najczęściej przyjmuje się stężenie IC50, czyli takie stężenie, które powoduje zahamowanie wzrostu badanej populacji komórek o 50%. Należy również zwrócić uwagę, że różniące się pochodzeniem linie komórkowe mogą wykazywać odmienną wrażliwość na tę samą substancję.
Anna Palko - Łabuz
